Auf ScienceDirekt findet sich ein Artikel von neun Forschern der Instituts für Virologie in Wuhan, China, zum Thema „monkeypox virus“ und DNA-Zusammenbau (Gentechnik). Der Beitrag erschien zuerst am 28. Februar 2022 in Virologica Sinica, der chinesischen virologischen Fachzeitschrift.
In dem Artikel mit dem Titel „Efficient assembly of a large fragment of monkeypox virus genome as a qPCR template using dual-selection based transformation-associated recombination“ („Effizienter Zusammenbau eines großen Genomfragments des Affenpockenvirus als qPCR-Matrize durch transformationsassoziierte Rekombination auf der Grundlage von Doppelselektion“) heißt es im Abstract:
„Transformation-associated recombination (TAR) has been widely used to assemble large DNA constructs. One of the significant obstacles hindering assembly efficiency is the presence of error-prone DNA repair pathways in yeast, which results in vector backbone recircularization or illegitimate recombination products. To increase TAR assembly efficiency, we prepared a dual-selective TAR vector, pGFCS, by adding a PADH1-URA3 cassette to a previously described yeast-bacteria shuttle vector, pGF, harboring a PHIS3–HIS3 cassette as a positive selection marker. This new cassette works as a negative selection marker to ensure that yeast harboring a recircularized vector cannot propagate in the presence of 5-fluoroorotic acid. To prevent pGFCS bearing ura3 from recombining with endogenous ura3-52 in the yeast genome, a highly transformable Saccharomyces cerevisiae strain, VL6-48B, was prepared by chromosomal substitution of ura3-52 with a transgene conferring resistance to blasticidin. A 55-kb genomic fragment of monkeypox virus encompassing primary detection targets for quantitative PCR was assembled by TAR using pGFCS in VL6-48B. The pGFCS-mediated TAR assembly showed a zero rate of vector recircularization and an average correct assembly yield of 79% indicating that the dual-selection strategy provides an efficient approach to optimizing TAR assembly.“
Übersetzung auf Deutsch mit deepl.com:
„Die transformationsassoziierte Rekombination (TAR) wird häufig für den Zusammenbau großer DNA-Konstrukte verwendet. Eines der größten Hindernisse für die Effizienz des Zusammenbaus ist das Vorhandensein von fehleranfälligen DNA-Reparaturwegen in Hefe, die zu einer Re-Zirkularisierung des Vektorrückgrats oder zu illegitimen Rekombinationsprodukten führen. Um die Effizienz des TAR-Aufbaus zu erhöhen, haben wir einen dual-selektiven TAR-Vektor, pGFCS, hergestellt, indem wir eine PADH1-URA3-Kassette zu einem zuvor beschriebenen Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektor, pGF, hinzugefügt haben, der eine PHIS3-HIS3-Kassette als positiven Selektionsmarker enthält. Diese neue Kassette wirkt als negativer Selektionsmarker, um sicherzustellen, dass Hefe, die einen rezirkularisierten Vektor trägt, sich in Gegenwart von 5-Fluorotinsäure nicht vermehren kann. Um zu verhindern, dass pGFCS, das Ura3 trägt, mit dem endogenen Ura3-52 im Hefegenom rekombiniert, wurde ein hochgradig transformierbarer Saccharomyces cerevisiae-Stamm, VL6-48B, durch chromosomale Substitution von Ura3-52 mit einem Transgen hergestellt, das eine Resistenz gegen Blasticidin verleiht. Ein 55-kb-Genomfragment des Affenpockenvirus, das die primären Nachweisziele für die quantitative PCR umfasst, wurde durch TAR mit pGFCS in VL6-48B assembliert. Die pGFCS-vermittelte TAR-Assemblierung zeigte eine Null-Rate der Vektor-Rezirkularisierung und eine durchschnittliche korrekte Assemblierungsausbeute von 79 %, was darauf hindeutet, dass die Dual-Selection-Strategie einen effizienten Ansatz zur Optimierung der TAR-Assemblierung bietet.“
